Vliv teplotních změn na buněčnou kulturu
Teplota je důležitým parametrem v buněčných kultuře, protože ovlivňuje reprodukovatelnost výsledků. Změny teploty nad nebo pod 37 °C mají velmi významný vliv na kinetiku růstu buněk savců, podobně jako u bakteriálních buněk. Změny v genové expresi a modifikace v buněčné struktuře, postupu buněčného cyklu a stabilitě mRNA lze v savčích buňkách detekovat po jedné hodině při 32 °C. Kromě přímého ovlivnění růstu buněk ovlivňují změny teploty také pH média, protože rozpustnost CO2 mění pH (pH se zvyšuje při nižších teplotách). Kultivované savčí buňky snášejí výrazné poklesy teploty. Mohou být skladovány při 4 °C po dobu několika dnů a snášejí zmrazení na -196 °C (za vhodných podmínek). Nesnášejí však teploty o více než několik hodin vyšší než přibližně 2 °C nad normál a při 40 °C a vyšších rychle hynou. Aby byla zajištěna maximální reprodukovatelnost výsledků, je třeba dbát na to, aby se během inkubace a manipulace s buňkami mimo inkubátor udržovala co nejkonstantnější teplota.
Důvody teplotních výkyvů uvnitř inkubátoru
Jistě jste si všimli, že po otevření dvířek inkubátoru teplota rychle klesne na nastavenou hodnotu 37 °C. Obecně se teplota obnoví během několika minut po zavření dvířek. Statické kultury ve skutečnosti potřebují čas, aby se v inkubátoru zotavily na nastavenou teplotu. Dobu, za kterou se buněčná kultura po ošetření mimo inkubátor znovu zahřeje, může ovlivnit řada faktorů.Mezi tyto faktory patří:
- ▶délka doby, po kterou byly buňky mimo inkubátor
- ▶typ baňky, ve které se buňky pěstují (geometrie ovlivňuje přenos tepla)
- ▶Počet nádob v inkubátoru.
- ▶Přímý kontakt baněk s ocelovou policí ovlivňuje výměnu tepla a rychlost dosažení optimální teploty, proto je lepší se vyhnout stohování baněk a umístit každou nádobu
- ▶přímo na polici inkubátoru.
Počáteční teplota použitých čerstvých nádob a médií také ovlivní dobu, za kterou buňky dosáhnou optimálního stavu; čím nižší je jejich teplota, tím déle to trvá.
Pokud se všechny tyto faktory v průběhu času mění, zvýší se také variabilita mezi experimenty. Je nutné minimalizovat tyto teplotní výkyvy, i když není vždy možné vše kontrolovat (zejména pokud stejný inkubátor používá více lidí).
Jak minimalizovat teplotní výkyvy a zkrátit dobu zotavení z teploty
Předehřátím média
Někteří výzkumníci jsou zvyklí předehřívat celé lahvičky s médiem ve vodní lázni o teplotě 37 °C, aby se před použitím dosáhly této teploty. Médium je také možné předehřát v inkubátoru, který se používá pouze pro předehřívání média, nikoli pro buněčné kultury, kde médium může dosáhnout optimální teploty, aniž by narušilo buněčné kultury v jiném inkubátoru. Pokud víme, to však obvykle není dostupný náklad.
Uvnitř inkubátoru
Otevírejte dvířka inkubátoru co nejméně a zavírejte je co nejrychleji. Vyhněte se chladným místům, která v inkubátoru vytvářejí teplotní rozdíly. Mezi baňkami nechte prostor pro cirkulaci vzduchu. Police uvnitř inkubátoru mohou být perforované. To umožňuje lepší rozložení tepla, protože umožňuje průchod vzduchu otvory. Přítomnost otvorů však může vést k rozdílům v růstu buněk, protože mezi oblastí s otvory a oblastí s meta je teplotní rozdíl. Z těchto důvodů, pokud vaše experimenty vyžadují vysoce rovnoměrný růst buněčné kultury, můžete kultivační baňky umístit na kovové podložky s menšími kontaktními plochami, které obvykle nejsou při běžné buněčné kultivaci nutné.
Minimalizace doby zpracování buněk
Abyste minimalizovali čas strávený procesem buněčné úpravy, je třeba
- ▶Před zahájením práce si připravte všechny potřebné materiály a nástroje.
- ▶Pracujte rychle a plynule a předem si projděte experimentální metody, aby se vaše operace staly opakujícími se a automatizovanými.
- ▶Minimalizujte kontakt kapalin s okolním vzduchem.
- ▶V laboratoři pro buněčné kultury, kde pracujete, udržujte konstantní teplotu.
Čas zveřejnění: 18. srpna 2023